一直以來大家都默認基因都是在染色體上，染色體外DNA（ecDNA）這一概念的出現(xiàn)可以說是顛覆了大家的傳統(tǒng)認知，原來研究了半天，竟是搞錯了方向，癌基因其實并不在我們關(guān)注的染色體上。由此，癌癥研究打開了一扇新大門。

ecDNA是一種存在于染色體外，高度開放的DNA 顆粒，普遍存在于人類癌細胞中。因其能通過基因擴增和改變基因調(diào)控來介導(dǎo)癌基因的高表達，被認為與腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性相關(guān)。

編碼致癌基因的ecDNA是癌癥基因組的普遍特征，也是癌癥進展的一個強有力的驅(qū)動因素。ecDNA是共價閉合雙鏈，大小從100千堿基到幾兆堿基不等。因缺乏著絲粒，ecDNA在細胞分裂過程中會隨機分布于子細胞，這就方便了其快速積累，而且可以重新整合到染色體中，因此也可作為某些染色體擴增的前體。ecDNA具有更高的染色質(zhì)可及性，但卻缺乏更高的染色質(zhì)致密性，且包含內(nèi)源性致癌基因增強子元件，這表明癌基因擴增子可能是通過調(diào)控依賴性來擴增轉(zhuǎn)錄的。因其本身存在于染色體外，目前對其細胞核中的空間還不清楚。ecDNA在細胞分裂期間或DNA損傷后會相互聚集，但其聚集后生物學(xué)后果目前還不甚了解。

11月24日，斯坦福大學(xué)HowardChang教授團隊在《Nature》發(fā)表了題為“ ecDNAhubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的論文，他們研究了致癌ecDNA的細胞核空間、表觀遺傳因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，發(fā)現(xiàn)聚集在間期細胞核中的ecDNA可以“抱團行動”，驅(qū)動分子間增強子信號來促使癌基因表達擴增。

   

ecDNA促進癌癥基因表達    

研究團隊通過DNA熒光原位雜交（FISH）來觀察間期細胞核中的ecDNA的聚集點，包括前列腺癌細胞系PC3（MYC擴增）、結(jié)直腸癌細胞系COLO320-DM（MYC擴增）、多形性成膠質(zhì)細胞瘤細胞系HK359（EGFR擴增）和胃癌細胞系SNU16（MYC和FGFR2擴增）。結(jié)果顯示，所有ecDNA陽性癌細胞中，除去有數(shù)十到數(shù)百個單獨的ecDNA分子，ecDNAFISH基本都集中在間期細胞核中，這表明ecDNA彼此之間有強烈的聚集，研究團隊將其稱為ecDNA中心。進一步實驗后發(fā)現(xiàn)，在具有不同癌基因擴增的各種癌癥類型和原發(fā)性腫瘤中均存在ecDNA聚集。

研究人員利用DNA和新生RNAFISH，在PC3和COLO320-DM細胞中觀察到活躍轉(zhuǎn)錄的MYC等位基因，并計算出每個ecDNA分子的MYC轉(zhuǎn)錄概率。大多數(shù)新生MYCmRNA轉(zhuǎn)錄本來自ecDNA中心，而不是來自染色體。此外，與單子ecDNA相比，ecDNA中心的轉(zhuǎn)錄活性更高。因此，ecDNAs中心聚集時，每個ecDNA分子更有可能轉(zhuǎn)錄致癌基因    

   

BRD4連接ecDNA中心和轉(zhuǎn)錄    

癌基因MYC包含MYC和漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1，拷貝數(shù)擴增相關(guān)的lncRNA，已知的癌癥相關(guān)區(qū)域），兩側(cè)是由組蛋白H3乙?；嚢彼?7（H3K27ac）和BET蛋白（如BRD4）為標記的超級增強因子。為了檢查活細胞中的MYCecDNA，研究人員在COLO320-DM細胞的MYCecDNA中插入了Tet-operator（TetO）陣列，并用Tet-eGFP標記了ecDNA，以盡量減少GFP二聚化?；罴毎上耧@示，有多個動態(tài)核病灶對應(yīng)ecDNA聚集。內(nèi)源性BRD4的表位標記顯示，BRD4在TetO標記的ecDNA中心高度富集。通過對H3K27ac和BRD4進行測序和染色質(zhì)免疫沉淀來分析染色質(zhì)，結(jié)果顯示標記活性H3K27ac的ecDNA也被BRD4占據(jù)。    

為了確定BET蛋白在ecDNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄中的作用，研究人員重點研究了同源的結(jié)直腸癌細胞系COLO320-DM（MYCecDNA）和COLO320-HSR（來源于同一患者腫瘤）。TetO-GFPCOLO320-DM細胞中進行的活細胞成像顯示，ecDNA中心在有絲分裂過程中被分解成更小的顆粒。分解后，ecDNAs又再次聚集成大中心。值得注意的是，有絲分裂后，ecDNA中心重新聚集被JQ1（BRD4抑制劑）阻斷。結(jié)果表明，在COLO320-DM細胞中，ecDNA中心的形成、維持和腫瘤基因轉(zhuǎn)錄對BET蛋白H3K27ac相互作用有獨特的依賴性。    

   

ecDNA中心反式激活    

為了將ecDNA結(jié)構(gòu)與MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)控聯(lián)系起來，研究團隊使用五種正交方法重建了COLO320-DM的ecDNA，報告了目前已知的組裝的大的ecDNA結(jié)構(gòu)，包含PVT1-MYC融合、標準MYC序列和來自多個染色體起源的序列（6、8、13和16號染色體）的多個拷貝，并且利用DNA FISH驗證了PLUT、PCAT1和MYC基因在重建預(yù)測的ecDNA上的共定位。    

研究團隊在COLO320-DM細胞中觀察到了PVT1啟動子處的強BRD4結(jié)合，但在COLO320-DMecDNA細胞中未觀察到。因PVT1啟動子能被MYC激活，研究團隊又假設(shè)PVT1-MYC融合可實現(xiàn)MYC表達的正反饋，避免PVT1和MYC啟動子之間的過度表達，但在幾種人類癌癥中觀察到了PVT1重排和基因融合并驅(qū)動基因過度表達。    

接下來，研究人員確定了與癌基因高表達相關(guān)的ecDNA調(diào)控元件。72049個來自COLO320-DM和COLO320-HSR細胞的配對單細胞ATAC–seq和RNA-seq，經(jīng)校正MYC拷貝數(shù)后確定了47個與高MYC表達相關(guān)的ecDNA調(diào)控元件，而目前驅(qū)動ecDNA上MYC癌基因表達的PVT1啟動子（PVT1p）在ecDNA中心內(nèi)接受了廣泛的組合增強子輸入。進一步實驗表明，分子間增強子-啟動子在ecDNA中心激活，同時研究人員證實PVT1p作為一種DNA元件，能夠反式激活ecDNA中心。    

   

ecDNA間的分子調(diào)控    

研究人員進一步研究了分子間增強子-基因相互作用是如何進行精確定位和干擾。以人胃癌細胞系SNU16為研究對象，其包含8號和11號染色體的MYC擴增子和10號染色體的成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）擴增子。H3K27ac的染色質(zhì)免疫沉淀和測序顯示FGFR2和MYCecDNA之間存在分子間接觸，并富集了焦點相互作用。CRISPR干擾（CRISPRi）靶向候選調(diào)控元件確定了與MYC或FGFR2在順式和反式表達相關(guān)的功能元件。    

實驗結(jié)果表明，F(xiàn)GFR2和MYCecDNA已被共同選擇，因此這兩個擴增子上的增強子可協(xié)同激活MYC表達。MYC蛋白繼而激活FGFR2表達。順式和反式調(diào)控元件之間幾乎沒有重疊，表明分子間增強子元件是直接修飾反式基因表達，而非通過下游效應(yīng)。癌癥類型中的分子間ecDNA的相互作用評估顯示，ecDNA中心的分子間增強子-基因激活發(fā)生在不同的腫瘤基因位點和多種癌癥類型。    

   

綜上所述，上述研究顯示ecDNA“抱團行動”促進了新的分子間增強子-基因相互作用和癌基因過表達，且可以發(fā)生在不同的腫瘤基因位點和多種癌癥類型中。與傳統(tǒng)的順式染色體轉(zhuǎn)錄不同，ecDNA中心反式調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)分子間轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這對如何實現(xiàn)更好的癌基因轉(zhuǎn)錄具有重要的啟示。