摘要：研究針對(duì)膽管癌患者對(duì)多重酪氨酸激酶抑制劑蘇法替尼耐藥的關(guān)鍵機(jī)制。

膽管癌是一種起源于膽管上皮的高度惡性腫瘤，因其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速且治療手段有限，患者預(yù)后極差。盡管手術(shù)切除是目前唯一可能治愈的方法，但多數(shù)患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)化療方案如吉西他濱聯(lián)合順鉑，雖然是一線標(biāo)準(zhǔn)治療，但療效有限，患者中位生存期難以令人滿意。近年來，靶向治療為膽管癌患者帶來了新的希望，特別是多重酪氨酸激酶抑制劑(mTKI)如蘇法替尼(surufatinib)在臨床應(yīng)用中顯示出一定的潛力。然而，與許多靶向藥物一樣，耐藥性問題日益凸顯，相當(dāng)一部分患者對(duì)mTKI治療無應(yīng)答或很快產(chǎn)生耐藥，這成為臨床實(shí)踐中的主要挑戰(zhàn)。

深入研究膽管癌靶向治療耐藥機(jī)制，對(duì)于提高治療效果、延長患者生存期具有重要意義。以往研究多關(guān)注于腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的基因突變或表觀遺傳改變，而對(duì)腫瘤微環(huán)境在耐藥中的作用關(guān)注相對(duì)不足。尤其值得注意的是，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)信號(hào)通路在多種腫瘤中被證實(shí)參與耐藥形成，但在膽管癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。同時(shí)，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)家族作為酪氨酸激酶的天然負(fù)調(diào)控因子，其在調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶(RTK)活性中的作用也值得深入探討。

 圖1 PTPN9通過去磷酸化IGF1R^Y1165/1166位點(diǎn)，緩解胰島素樣生長因子1受體介導(dǎo)的膽管癌對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性

發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上的這項(xiàng)研究，由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普通外科張志利教授團(tuán)隊(duì)完成，系統(tǒng)闡述了PTPN9-IGF1R信號(hào)軸在膽管癌mTKI耐藥中的關(guān)鍵作用。研究人員通過臨床樣本分析、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型驗(yàn)證，揭示了腫瘤微環(huán)境中癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)來源的IGF1通過激活I(lǐng)GF1R，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)蘇法替尼的耐藥；而PTPN9作為重要的負(fù)調(diào)控因子，能夠逆轉(zhuǎn)這一過程。

為開展此項(xiàng)研究，研究人員采用了多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)方法：利用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析(IP-MS)篩選PTPN9的作用底物；通過晶體結(jié)構(gòu)解析明確PTPN9與IGF1R的相互作用機(jī)制；建立正交小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)藥效驗(yàn)證；采用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)分析腫瘤微環(huán)境中IGF1的來源；并通過組織微陣列(TMA)和免疫組化分析臨床樣本中PTPN9和IGF1R的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。臨床樣本來源于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收治的膽管癌患者。

PTPN9-IGF1R介導(dǎo)TKI耐藥在膽管癌中的作用

研究人員首先比較了蘇法替尼應(yīng)答與非應(yīng)答膽管癌患者腫瘤組織中PTPN9的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)非應(yīng)答組PTPN9表達(dá)顯著降低，提示PTPN9可能與蘇法替尼耐藥相關(guān)。通過建立正交膽管癌小鼠模型，證實(shí)PTPN9過表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)蘇法替尼的敏感性，而敲低PTPN9則導(dǎo)致耐藥。

進(jìn)一步的機(jī)制探索中，研究人員通過IP-MS技術(shù)篩選出IGF1R是PTPN9的潛在新底物。TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示IGF1R在膽管癌組織中顯著高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTPN9與IGG1R存在直接相互作用，且在蘇法替尼應(yīng)答患者組織中，PTPN9與IGF1R有明顯的共定位，而非應(yīng)答組織中這種共定位顯著減少。

PTPN9相互作用并去磷酸化IGF1R^Y1165/1166在膽管癌中

生物信息學(xué)分析顯示，IGF1R磷酸化位點(diǎn)^Y1165/1166周圍序列與已知的PTPN9底物(如TrkA^Y674/675和FGFR2^Y656/657)具有高度同源性。酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTPN9與p-IGF1R^Y1165/1166之間的酶-底物關(guān)系。

功能實(shí)驗(yàn)表明，敲低PTPN9增強(qiáng)了IGF1刺激的IGF1R^Y1165/1166磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；而過表達(dá)PTPN9則產(chǎn)生相反效果。IGF1R的激活突變(^Y1165/1166E)增強(qiáng)而失活突變(^Y1165/1166F)減弱了這些惡性表型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，IGF1促進(jìn)而IGF1R抑制劑林西替尼(linsitinib)抑制了腫瘤生長。

IGF1R旁路激活促進(jìn)膽管癌中TKI耐藥

臨床樣本分析顯示，IGF1R在膽管癌組織中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)。通過逐步劑量遞增法建立的蘇法替尼耐藥細(xì)胞株(QBC-939/SR)顯示出對(duì)蘇法替尼的耐受性增強(qiáng)，同時(shí)伴有IGF1R^Y1165/1166磷酸化水平升高以及下游PI3K-Akt和MEK-Erk通路激活。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，蘇法替尼與林西替尼聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制了腫瘤生長，效果優(yōu)于單藥治療。IGF1R過表達(dá)或^Y1165/1166激活突變減弱了蘇法替尼的抑瘤效果，而失活突變則增強(qiáng)了藥物敏感性，證實(shí)IGF1R磷酸化狀態(tài)是決定TKI敏感性的關(guān)鍵因素。

PTPN9識(shí)別和去磷酸化IGF1R^Y1165/1166的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

通過X射線晶體學(xué)分析，研究人員解析了PTPN9與p-IGF1R^Y1165/1166短肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)2.0埃。結(jié)構(gòu)分析顯示，p-Y1166深入PTPN9催化中心，引起WPD環(huán)向內(nèi)移動(dòng)6.7埃，β3-β4環(huán)向外移動(dòng)2.5埃，這些構(gòu)象變化對(duì)酶活性至關(guān)重要。

Tyr333和Asp335是PTPN9-IGF1R相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)

酶動(dòng)力學(xué)分析顯示，PTPN9對(duì)p-IGF1R^Y1165/1166具有較高的催化效率，尤其偏好Y1166位點(diǎn)。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tyr333和Asp335是維持PTPN9催化活性的關(guān)鍵殘基，它們的突變顯著降低了酶活性。功能實(shí)驗(yàn)表明，這些關(guān)鍵位點(diǎn)的突變削弱了PTPN9對(duì)IGF1R信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用。

CAF來源的IGF1激活I(lǐng)GF1R并促進(jìn)膽管癌進(jìn)展

單細(xì)胞RNA測序分析顯示，成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中IGF1的主要來源。通過分離原代癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)并檢測其條件培養(yǎng)基，證實(shí)CAF分泌高水平的IGF1。功能實(shí)驗(yàn)表明，CAF條件培養(yǎng)基促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而這一效應(yīng)可被IGF1中和抗體或IGF1R敲低所逆轉(zhuǎn)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，與CAF共注射顯著促進(jìn)腫瘤生長，而CAF中IGF1敲低或使用IGF1中和抗體則抑制腫瘤發(fā)展。IGF1R敲低的腫瘤細(xì)胞對(duì)CAF條件培養(yǎng)基的促瘤作用不敏感，而過表達(dá)IGF1R則增強(qiáng)這一效應(yīng)。

討論與結(jié)論

本研究系統(tǒng)闡明了CAF來源的IGF1/PTPN9-IGF1R信號(hào)軸在膽管癌進(jìn)展和TKI耐藥中的核心作用。研究發(fā)現(xiàn)不僅揭示了IGF1R作為膽管癌不良預(yù)后因子的臨床意義，還首次明確了PTPN9作為IGF1R磷酸酶的功能及其在調(diào)節(jié)TKI敏感性中的關(guān)鍵作用。

從機(jī)制角度看，本研究有多項(xiàng)重要發(fā)現(xiàn)：首先，通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段精確解析了PTPN9與IGF1R相互作用的分子基礎(chǔ)，鑒定出Tyr333和Asp335是關(guān)鍵催化殘基；其次，利用單細(xì)胞技術(shù)明確了CAF是腫瘤微環(huán)境中IGF1的主要來源，深化了對(duì)腫瘤-基質(zhì)相互作用的理解；第三，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTPN9下調(diào)是導(dǎo)致IGF1R信號(hào)異常激活的重要原因；最后，治療學(xué)實(shí)驗(yàn)證明聯(lián)合應(yīng)用IGF1R抑制劑林西替尼可有效逆轉(zhuǎn)蘇法替尼耐藥。

這些發(fā)現(xiàn)對(duì)膽管癌臨床實(shí)踐具有重要指導(dǎo)意義：一方面，PTPN9表達(dá)和IGF1R磷酸化狀態(tài)可作為預(yù)測mTKI療效的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)治療前患者分層；另一方面，蘇法替尼與林西替尼的聯(lián)合使用策略為克服耐藥提供了新思路?？紤]到林西替尼已在早期臨床試驗(yàn)中顯示出可管理的安全性，這一聯(lián)合方案具有較好的臨床轉(zhuǎn)化前景。

值得注意的是，本研究也存在一定局限性，如僅使用單一耐藥細(xì)胞系可能無法涵蓋所有耐藥機(jī)制，以及林西替尼對(duì)胰島素受體(IR)的抑制可能帶來代謝副作用等。未來研究可探索新一代IGF1R選擇性降解劑，以提高靶向特異性并改善安全性。

總體而言，這項(xiàng)研究深化了對(duì)膽管癌靶向治療耐藥機(jī)制的理解，提出了基于生物標(biāo)志物的精準(zhǔn)治療策略，為改善膽管癌患者預(yù)后提供了新的思路和方法。通過同時(shí)靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)在信號(hào)和微環(huán)境調(diào)控，有望實(shí)現(xiàn)更有效、更持久的治療效果。

[1] PTPN9 dephosphorylates IGF1R^Y1165/1166 and alleviates IGF1R-mediated resistance to tyrosine kinase inhibitor in cholangiocarcinoma