摘要：研究首次在記憶相關(guān)神經(jīng)元集群中實現(xiàn)了對Arc基因啟動子的細(xì)胞特異性、位點特異性表觀遺傳編輯。
記憶是如何形成的？這個問題困擾了神經(jīng)科學(xué)家數(shù)十年。表觀遺傳機(jī)制長期被認(rèn)為是分子記憶載體，但單個基因組位點的表觀遺傳特征是否能直接調(diào)控習(xí)得行為仍屬未知。傳統(tǒng)研究多通過藥理學(xué)或遺傳學(xué)手段靶向表觀遺傳酶類來間接影響記憶功能，缺乏對特定基因組位點的因果性干預(yù)證據(jù)。
近年來，研究發(fā)現(xiàn)記憶被編碼在稀疏的腦細(xì)胞群體——印跡細(xì)胞（engram cells）中。這些細(xì)胞在學(xué)習(xí)過程中被激活，表現(xiàn)出增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)和突觸可塑性，被認(rèn)為是記憶痕跡的物理載體。學(xué)習(xí)后，印跡細(xì)胞會呈現(xiàn)表觀遺傳修飾，這為在細(xì)胞類型和基因座分辨率下探究其記憶功能提供了理想模型。
圖1 細(xì)胞類型與位點特異性的記憶表達(dá)表觀遺傳編輯
在此背景下，洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院（EPFL）的Johannes Graff團(tuán)隊在《Nature Genetics》發(fā)表了創(chuàng)新性研究。他們聚焦于Arc基因——突觸可塑性的關(guān)鍵調(diào)控因子，其啟動子區(qū)域在小鼠齒狀回（DG）中比其他即刻早期基因（IEGs）具有更高的染色質(zhì)可及性。這種"預(yù)備"狀態(tài)的染色質(zhì)為探究位點特異性表觀遺傳調(diào)控的重要性提供了理想靶點。
研究人員開發(fā)了一套時空可誘導(dǎo)的CRISPR表觀遺傳編輯系統(tǒng)，將其與c-Fos驅(qū)動的印跡細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合。通過使用可被多西環(huán)素（DOX）調(diào)控的Tet響應(yīng)元件（TRE）系統(tǒng)，他們能夠在學(xué)習(xí)激活的印跡細(xì)胞中特異性表達(dá)表觀遺傳編輯器。
研究主要采用了以下幾種關(guān)鍵技術(shù)方法：一是構(gòu)建了時空可誘導(dǎo)的CRISPR-dCas9表觀遺傳編輯系統(tǒng)（包括抑制型dCas9-KRAB-MeCP2和激活型dCas9-VPR/dCas9-CBP），通過慢病毒載體遞送至cFos-tTA或cFos-CreERT2/rtTALSL轉(zhuǎn)基因小鼠的齒狀回；二是運用情境恐懼條件反射（CFC）行為學(xué)范式評估記憶功能；三是通過RNAscope、免疫熒光、ChIP-seq/qPCR、scATAC-seq和scRNA-seq等多組學(xué)技術(shù)，在分子和細(xì)胞水平驗證表觀遺傳編輯的效果及特異性；四是利用抗CRISPR蛋白AcrIIA4建立可逆編輯系統(tǒng)，驗證記憶效應(yīng)的可塑性。
圖2 從表觀遺傳層面抑制記憶形成
研究人員首先利用dCas9-KRAB-MeCP2系統(tǒng)表觀遺傳抑制Arc啟動子。發(fā)現(xiàn)與注射非靶向（NT）sgRNA的動物相比，注射Arc sgRNA的動物表現(xiàn)出記憶形成受損。分子水平上，dCas9-KRAB-MeCP2結(jié)合Arc啟動子降低了轉(zhuǎn)錄相關(guān)染色質(zhì)標(biāo)記H3K27ac的占據(jù)，導(dǎo)致Arc mRNA下調(diào)。scATAC-seq分析顯示dCas9-KRAB-MeCP2表達(dá)導(dǎo)致Arc啟動子關(guān)閉。
相反，使用dCas9-VPR系統(tǒng)表觀遺傳激活A(yù)rc啟動子，在亞閾值CFC協(xié)議下顯著改善了記憶回憶。表觀遺傳分析顯示dCas9-VPR結(jié)合Arc啟動子增加了H3K27ac、H3K14ac和Arc mRNA，這一效應(yīng)可能通過直接與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CREB結(jié)合蛋白（CBP）相互作用介導(dǎo)。表達(dá)dCas9-CBP在DG印跡細(xì)胞中能完全重現(xiàn)dCas9-VPR的行為、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。
為驗證表觀遺傳編輯效應(yīng)的可塑性，研究人員使用了抗CRISPR蛋白AcrIIA4，該蛋白通過遮蔽dCas9的PAM識別域來negate dCas9結(jié)合。通過設(shè)計雙轉(zhuǎn)基因標(biāo)記系統(tǒng)，實現(xiàn)在同一印跡細(xì)胞中順序誘導(dǎo)dCas9-VPR和AcrIIA4。發(fā)現(xiàn)AcrIIA4誘導(dǎo)可逆轉(zhuǎn)dCas9-VPR介導(dǎo)的記憶增強(qiáng)，證明觀察到的行為效應(yīng)是Arc表觀遺傳調(diào)控的直接結(jié)果。
最后，研究證明Arc的表觀遺傳調(diào)控在記憶鞏固后仍然有效。在CFC后4天（超過記憶形成后的初始不穩(wěn)定期）誘導(dǎo)dCas9-VPR或dCas9-KRAB-MeCP2表達(dá)，仍能分別雙向改變記憶表達(dá)，表明即使對于完全鞏固的記憶，Arc的表觀遺傳編輯也能調(diào)控其表達(dá)。
研究結(jié)論表明，通過設(shè)計印跡細(xì)胞中時空可誘導(dǎo)的CRISPR表觀遺傳編輯系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)單個基因座的表觀遺傳特征足以調(diào)控記憶表達(dá)。這種效應(yīng)不依賴于記憶階段——在學(xué)習(xí)后的初始不穩(wěn)定期和完全鞏固的記憶階段均存在，且在同一動物體內(nèi)可逆，證明了其固有的可塑性。
這些發(fā)現(xiàn)提供了原理證明，表明位點特異性表觀遺傳動力學(xué)與記憶表達(dá)存在因果關(guān)聯(lián)。從機(jī)制角度拓展了先前關(guān)于轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)景觀在記憶過程中如何展開的觀察性研究，超越了通過藥理學(xué)或遺傳學(xué)靶向表觀遺傳機(jī)器的干預(yù)方法。
該研究的方法學(xué)意義在于展示了表觀遺傳編輯工具（包括抗CRISPR蛋白AcrIIA4）如何被引導(dǎo)至成年小鼠大腦中的特定細(xì)胞群體。這種模塊化設(shè)置未來可用于從細(xì)胞類型特異性和基因座分辨的表觀遺傳調(diào)控角度更好地理解其他表型，不僅在記憶研究領(lǐng)域，還可應(yīng)用于發(fā)育、炎癥或免疫激活后建立的細(xì)胞記憶研究。
總之，這項研究為表觀遺傳機(jī)制作為記憶表達(dá)的因果調(diào)控因子提供了最精細(xì)的證據(jù)，揭示了染色質(zhì)改變作為功能相關(guān)的記憶載體，在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)信息的行為表達(dá)中的重要作用。
參考資料
[1] Cell-type- and locus-specific epigenetic editing of memory expression
摘要：研究首次在記憶相關(guān)神經(jīng)元集群中實現(xiàn)了對Arc基因啟動子的細(xì)胞特異性、位點特異性表觀遺傳編輯。
記憶是如何形成的？這個問題困擾了神經(jīng)科學(xué)家數(shù)十年。表觀遺傳機(jī)制長期被認(rèn)為是分子記憶載體，但單個基因組位點的表觀遺傳特征是否能直接調(diào)控習(xí)得行為仍屬未知。傳統(tǒng)研究多通過藥理學(xué)或遺傳學(xué)手段靶向表觀遺傳酶類來間接影響記憶功能，缺乏對特定基因組位點的因果性干預(yù)證據(jù)。
近年來，研究發(fā)現(xiàn)記憶被編碼在稀疏的腦細(xì)胞群體——印跡細(xì)胞（engram cells）中。這些細(xì)胞在學(xué)習(xí)過程中被激活，表現(xiàn)出增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)和突觸可塑性，被認(rèn)為是記憶痕跡的物理載體。學(xué)習(xí)后，印跡細(xì)胞會呈現(xiàn)表觀遺傳修飾，這為在細(xì)胞類型和基因座分辨率下探究其記憶功能提供了理想模型。
圖1 細(xì)胞類型與位點特異性的記憶表達(dá)表觀遺傳編輯
在此背景下，洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院（EPFL）的Johannes Graff團(tuán)隊在《Nature Genetics》發(fā)表了創(chuàng)新性研究。他們聚焦于Arc基因——突觸可塑性的關(guān)鍵調(diào)控因子，其啟動子區(qū)域在小鼠齒狀回（DG）中比其他即刻早期基因（IEGs）具有更高的染色質(zhì)可及性。這種"預(yù)備"狀態(tài)的染色質(zhì)為探究位點特異性表觀遺傳調(diào)控的重要性提供了理想靶點。
研究人員開發(fā)了一套時空可誘導(dǎo)的CRISPR表觀遺傳編輯系統(tǒng)，將其與c-Fos驅(qū)動的印跡細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合。通過使用可被多西環(huán)素（DOX）調(diào)控的Tet響應(yīng)元件（TRE）系統(tǒng)，他們能夠在學(xué)習(xí)激活的印跡細(xì)胞中特異性表達(dá)表觀遺傳編輯器。
研究主要采用了以下幾種關(guān)鍵技術(shù)方法：一是構(gòu)建了時空可誘導(dǎo)的CRISPR-dCas9表觀遺傳編輯系統(tǒng)（包括抑制型dCas9-KRAB-MeCP2和激活型dCas9-VPR/dCas9-CBP），通過慢病毒載體遞送至cFos-tTA或cFos-CreERT2/rtTALSL轉(zhuǎn)基因小鼠的齒狀回；二是運用情境恐懼條件反射（CFC）行為學(xué)范式評估記憶功能；三是通過RNAscope、免疫熒光、ChIP-seq/qPCR、scATAC-seq和scRNA-seq等多組學(xué)技術(shù)，在分子和細(xì)胞水平驗證表觀遺傳編輯的效果及特異性；四是利用抗CRISPR蛋白AcrIIA4建立可逆編輯系統(tǒng)，驗證記憶效應(yīng)的可塑性。
圖2 從表觀遺傳層面抑制記憶形成
研究人員首先利用dCas9-KRAB-MeCP2系統(tǒng)表觀遺傳抑制Arc啟動子。發(fā)現(xiàn)與注射非靶向（NT）sgRNA的動物相比，注射Arc sgRNA的動物表現(xiàn)出記憶形成受損。分子水平上，dCas9-KRAB-MeCP2結(jié)合Arc啟動子降低了轉(zhuǎn)錄相關(guān)染色質(zhì)標(biāo)記H3K27ac的占據(jù)，導(dǎo)致Arc mRNA下調(diào)。scATAC-seq分析顯示dCas9-KRAB-MeCP2表達(dá)導(dǎo)致Arc啟動子關(guān)閉。
相反，使用dCas9-VPR系統(tǒng)表觀遺傳激活A(yù)rc啟動子，在亞閾值CFC協(xié)議下顯著改善了記憶回憶。表觀遺傳分析顯示dCas9-VPR結(jié)合Arc啟動子增加了H3K27ac、H3K14ac和Arc mRNA，這一效應(yīng)可能通過直接與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CREB結(jié)合蛋白（CBP）相互作用介導(dǎo)。表達(dá)dCas9-CBP在DG印跡細(xì)胞中能完全重現(xiàn)dCas9-VPR的行為、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。
為驗證表觀遺傳編輯效應(yīng)的可塑性，研究人員使用了抗CRISPR蛋白AcrIIA4，該蛋白通過遮蔽dCas9的PAM識別域來negate dCas9結(jié)合。通過設(shè)計雙轉(zhuǎn)基因標(biāo)記系統(tǒng)，實現(xiàn)在同一印跡細(xì)胞中順序誘導(dǎo)dCas9-VPR和AcrIIA4。發(fā)現(xiàn)AcrIIA4誘導(dǎo)可逆轉(zhuǎn)dCas9-VPR介導(dǎo)的記憶增強(qiáng)，證明觀察到的行為效應(yīng)是Arc表觀遺傳調(diào)控的直接結(jié)果。
最后，研究證明Arc的表觀遺傳調(diào)控在記憶鞏固后仍然有效。在CFC后4天（超過記憶形成后的初始不穩(wěn)定期）誘導(dǎo)dCas9-VPR或dCas9-KRAB-MeCP2表達(dá)，仍能分別雙向改變記憶表達(dá)，表明即使對于完全鞏固的記憶，Arc的表觀遺傳編輯也能調(diào)控其表達(dá)。
研究結(jié)論表明，通過設(shè)計印跡細(xì)胞中時空可誘導(dǎo)的CRISPR表觀遺傳編輯系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)單個基因座的表觀遺傳特征足以調(diào)控記憶表達(dá)。這種效應(yīng)不依賴于記憶階段——在學(xué)習(xí)后的初始不穩(wěn)定期和完全鞏固的記憶階段均存在，且在同一動物體內(nèi)可逆，證明了其固有的可塑性。
這些發(fā)現(xiàn)提供了原理證明，表明位點特異性表觀遺傳動力學(xué)與記憶表達(dá)存在因果關(guān)聯(lián)。從機(jī)制角度拓展了先前關(guān)于轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)景觀在記憶過程中如何展開的觀察性研究，超越了通過藥理學(xué)或遺傳學(xué)靶向表觀遺傳機(jī)器的干預(yù)方法。
該研究的方法學(xué)意義在于展示了表觀遺傳編輯工具（包括抗CRISPR蛋白AcrIIA4）如何被引導(dǎo)至成年小鼠大腦中的特定細(xì)胞群體。這種模塊化設(shè)置未來可用于從細(xì)胞類型特異性和基因座分辨的表觀遺傳調(diào)控角度更好地理解其他表型，不僅在記憶研究領(lǐng)域，還可應(yīng)用于發(fā)育、炎癥或免疫激活后建立的細(xì)胞記憶研究。
總之，這項研究為表觀遺傳機(jī)制作為記憶表達(dá)的因果調(diào)控因子提供了最精細(xì)的證據(jù)，揭示了染色質(zhì)改變作為功能相關(guān)的記憶載體，在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)信息的行為表達(dá)中的重要作用。
參考資料
[1] Cell-type- and locus-specific epigenetic editing of memory expression
