細(xì)胞治療是指將正?；蚪?jīng)過基因工程改造的人體細(xì)胞輸入患者體內(nèi)，新輸入的細(xì)胞可以替代受損細(xì)胞或者具有更強的免疫殺傷功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。細(xì)胞療法在治療腫瘤（包括實體瘤和血液瘤）、自免疾病等方面顯示出越來越高的應(yīng)用價值。一般來講，細(xì)胞治療包括免疫細(xì)胞治療和干細(xì)胞治療。

免疫細(xì)胞治療主要包括了T細(xì)胞治療、NK細(xì)胞治療、淋巴細(xì)胞治療、DC細(xì)胞治療。干細(xì)胞治療包括了多能誘導(dǎo)干細(xì)胞療法，也包括了間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等其他干細(xì)胞療法。

在腫瘤治療和自免疾病治療領(lǐng)域，近些年來不斷取得技術(shù)突破并走向商業(yè)化的產(chǎn)品，主要集中于免疫細(xì)胞治療和以多能誘導(dǎo)干細(xì)胞為來源的免疫細(xì)胞療法。包括了CAR-T療法、TCR-T療法、CAR-NK療法、TIL療法，DC細(xì)胞治療也有所發(fā)展。近年來，不僅自體CAR-T療法有多款產(chǎn)品獲批上市，通用型CAR-T療法，也有了突破性的發(fā)展成果。

已經(jīng)商業(yè)化和即將商業(yè)化的產(chǎn)品主要集中于自體免疫細(xì)胞治療，其中CAR-T占了大多數(shù)，TCR-T和CAR-NK產(chǎn)品也多有進(jìn)展靠前的產(chǎn)品。

兩種針對T細(xì)胞開展工程改造，提升其特異性殺傷腫瘤細(xì)胞效果的治療技術(shù)。基于HIV-1的慢病毒載體因其感染T細(xì)胞的能力，成為了改造T細(xì)胞的有效載體。在多年工藝探索后，慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)體系目前是T細(xì)胞改造的主流方法，T細(xì)胞改造質(zhì)量可靠且穩(wěn)定，形成了相對可控的工藝體系。工藝所涉原料詳見文末原料列表。

CAR-T細(xì)胞治療，即嵌合抗原受體T細(xì)胞治療，是將人的T細(xì)胞經(jīng)過基因工程手段體外修飾改造后，回輸患者體內(nèi)。改造后的T細(xì)胞，可識別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，并通過免疫作用釋放大量的多種效應(yīng)因子，它們能高效地殺滅腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療惡性腫瘤的目的。

對T細(xì)胞的改造主要是進(jìn)行CAR分子的“安裝”。CAR（嵌合抗原受體）是抗體的抗原結(jié)合區(qū) scFv 與 CD3-ζ 鏈或 FcεRIγ 的胞內(nèi)部分進(jìn)行融合形成，是 CAR-T 的核心部件。與TCR介導(dǎo)的抗原識別相比，CAR的抗原識別并不依賴于主要的組織相容性復(fù)合體（MHC），改造成功的CAR-T細(xì)胞可直接通過CAR分子識別特異性抗原。

CAR結(jié)構(gòu)通常也由三部分組成，即胞外抗原結(jié)合區(qū)（一般為scFv）、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過多年發(fā)展，CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)展至第四第五代，CAR結(jié)構(gòu)的改進(jìn)主要集中在胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域。有學(xué)者在第四代CAR-T的設(shè)計中添加細(xì)胞因子或趨化因子受體結(jié)構(gòu)，從而增加T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤，達(dá)到增強殺傷實體瘤的效果。第五代CAR在共刺激域（如CD28或4-1BB）和CD3ζ鏈之間，插入了IL-2Rβ等細(xì)胞因子受體的胞內(nèi)片段，當(dāng)CAR結(jié)合抗原后，該片段包含的YXXQ基序（Y代表酪氨酸）招募并激活JAK激酶和STAT蛋白，從而同時啟動T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子驅(qū)動的增殖信號。

TCR-T療法依賴T細(xì)胞受體(TCR)與MHC呈遞的胞內(nèi)抗原結(jié)合識別腫瘤細(xì)胞。MHC有兩種類型MHC-I與MHC-II，由人類6號染色體短臂上的人類白細(xì)胞抗原(HLA)基因座編碼，在細(xì)胞表面不同程度表達(dá)。其中，HLA-A、HLA-B及HLA-C編碼MHC-I型分子，HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP編碼MHC-II型分子。MHC-I負(fù)責(zé)呈遞內(nèi)源性抗原信號分子，它在幾乎所有有核細(xì)胞表面表達(dá)，由一條α鏈和β球蛋白組成，其中α1和α2兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個溝(Groove)，這是肽段結(jié)合區(qū)，其允許抗原多肽片段結(jié)合并呈遞到細(xì)胞膜表面。MHC-II負(fù)責(zé)呈遞外源性信號分子，在抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面表達(dá)，如單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及B細(xì)胞等。MHC-II由α和β兩條鏈組成，其中α1與β1之間形成的溝能參與抗原多肽片段的結(jié)合。

內(nèi)源性抗原是細(xì)胞自身產(chǎn)生的蛋白，如病毒感染后利用宿主細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)外殼或癌變的腫瘤蛋白。在細(xì)胞內(nèi)，這些內(nèi)源性蛋白在被自身細(xì)胞處理后會形成小分子肽段，然后與MHC-I結(jié)合形成pMHC-I復(fù)合物，并被呈遞到細(xì)胞膜表面與CD8+ T細(xì)胞結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡或程序性死亡。TCR-T細(xì)胞的激活也依賴于CD3分子的信號傳導(dǎo)，依賴于各個亞基的免疫受體絡(luò)氨酸活化基序（ITAM）磷酸化實現(xiàn)。

 

TCR-T與CAR-T都是經(jīng)基因工程改造的T細(xì)胞，使其具有特異識別并清除腫瘤的能力，然后回輸?shù)襟w內(nèi)以達(dá)到治療癌癥的目的。CAR-T識別的靶抗原都是細(xì)胞表面蛋白，這些靶蛋白的數(shù)量是有限的。TCR-T可以識別MHC分子呈遞的細(xì)胞內(nèi)多肽片段，因此TCR-T的靶抗原范圍更廣。TCR-T的技術(shù)核心是修飾TCR與腫瘤抗原的結(jié)合，人體內(nèi)天然的TCR對這些抗原的親和力相對較低，因此無法識別和殺死腫瘤細(xì)胞。人工設(shè)計的高親和力TCR在識別腫瘤細(xì)胞的過程中增強了特異性識別和親和力。

TCR-T治療是依賴于MHC分子的呈遞來識別和激活T細(xì)胞，這也是TCR-T的缺點。MHC由HLA基因編碼，該基因是人類基因組中多態(tài)性最強的基因。在接受TCR-T治療的患者不僅必須表達(dá)靶向抗原，還必須表達(dá)相應(yīng)的HLA等位基因抗原。因此，TCR-T療法通常使用僅限于相對常見的HLA等位基因的TCR。

 

早先CIK細(xì)胞培養(yǎng)中，很多人忽略CD28抗體對T細(xì)胞活化及防止T細(xì)胞失能的效果。T細(xì)胞的有效活化依賴于TCR途徑的激活和共刺激信號特別是CD28信號途徑的激活。

依靠IL-2的傳統(tǒng)培養(yǎng)中,激活擴增得到的T細(xì)胞中，完全分化的效應(yīng)T細(xì)胞（TEF）占比更多。在使用IL-15部分替代IL-2的培養(yǎng)中，未完全分化的記憶T細(xì)胞（Tscm）的占比較僅以IL-2的顯著的多，研究表明，T細(xì)胞亞群的選擇是CAR-T細(xì)胞治療效果的基礎(chǔ)。在這方面，中央記憶T細(xì)胞（TCM）的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎對體內(nèi)有效的細(xì)胞擴張、存活和持久性至關(guān)重要，同樣數(shù)量細(xì)胞移植，移植Tscm的子代細(xì)胞數(shù)量較Tcm高10~100倍（Gattinoni L, Nat. Med.,2011）。此外，選擇幼稚或分化程度較低的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)可以使輸注后T細(xì)胞增殖和體內(nèi)持久性增加。

Hopkins B等人進(jìn)行了一項實驗設(shè)計，研究不同組合IL-2、IL-7、IL-15對T細(xì)胞亞群生長的影響。結(jié)果表明，CD4+和CD8+ na?ve T細(xì)胞分別在中等濃度的IL-2和IL-7組合以及IL-7作用下可以有效生長。CD4+和CD8+記憶細(xì)胞分別在中等濃度IL-2和IL-15組合以及中等濃度IL-7和IL-15組合中有利。Coppola C等研究結(jié)果表明IL-2和IL-7在促進(jìn)活化的CD4+ T細(xì)胞的最佳增殖和存活方面存在協(xié)同作用。

與T細(xì)胞的殺傷作用機制不同，NK細(xì)胞的殺傷活性受細(xì)胞表面的抑制性受體和激活性受體的共同調(diào)控，當(dāng)激活與抑制的平衡被打破，NK細(xì)胞便會行使相應(yīng)的功能。

具體來講，NK細(xì)胞表面的抑制性受體（主要是抑制性殺傷性Ig樣受體KIRs和異二聚體C型凝集素受體NKG2A）可與靶細(xì)胞表面的MHC I結(jié)合并傳遞抑制信號，從而使NK細(xì)胞進(jìn)入“沉默”狀態(tài)；而NK細(xì)胞表面的激活性受體（主要是NCRs、NKp46、NKp30、NKp44和NKG2D）與可與細(xì)胞表面的特異性激活配體結(jié)合，從而激活NK細(xì)胞。

NK細(xì)胞主要通過三種機制殺傷靶細(xì)胞：

1. 通過釋放含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞質(zhì)顆粒直接殺傷靶細(xì)胞

2. 釋放細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，通過與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體的相互作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3. Fc受體CD16與抗體的Fc段結(jié)合，可激發(fā)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）來殺傷細(xì)胞。

生理情況下，NK細(xì)胞抑制性受體識別正常組織細(xì)胞表面廣泛表達(dá)的MHC-Ⅰ類分子而使NK細(xì)胞功能受到抑制，無法殺傷自身正常組織細(xì)胞。在腫瘤組織中，一方面腫瘤細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類分子表達(dá)通常發(fā)生下調(diào)，另一方面活化受體的配體如NKp30、NKp44、NKp46等表達(dá)上調(diào)，這兩方面的因素將導(dǎo)致NK細(xì)胞活化最終殺傷腫瘤細(xì)胞。

 

CAR-NK細(xì)胞的CAR結(jié)構(gòu)通常也由三部分組成，這與CAR-T細(xì)胞療法中使用的CAR結(jié)構(gòu)十分類似，事實上，目前的很多研究直接是把CAR-T中成熟的CAR結(jié)構(gòu)在NK細(xì)胞系中表達(dá)來制備CAR-NK。與CAR-T中常見的CAR結(jié)構(gòu)相比，CAR-NK還可以選擇NKG2D作為CAR結(jié)構(gòu)的識別結(jié)構(gòu)域，原因是腫瘤中普遍發(fā)生NKG2D的配體NKG2DL表達(dá)的上調(diào)。

 

不同于HIV-1病毒改造后的慢病毒載體感染T細(xì)胞，NK細(xì)胞缺乏高效的慢病毒載體。目前，主要采用瞬轉(zhuǎn)工藝作為生產(chǎn)工藝。

細(xì)胞因子是維持NK細(xì)胞存活和支持NK細(xì)胞體外增殖的關(guān)鍵成分，可以不需要滋養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。然而，當(dāng)使用不同的細(xì)胞因子和培養(yǎng)條件時，發(fā)現(xiàn)具有不同的擴增效率。

除了僅使用細(xì)胞因子的策略外，還有細(xì)胞因子和飼養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合使用的策略，飼養(yǎng)細(xì)胞包括照射的腫瘤細(xì)胞、同種異體PBMCs和淋巴母細(xì)胞衍生物等。缺乏人類白細(xì)胞抗原表達(dá)的K562細(xì)胞能通過激活共刺激信號促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，據(jù)報道，當(dāng)K562細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞與IL-2和IL-15聯(lián)合使用時，NK細(xì)胞的擴增超過300倍。

 

腫瘤細(xì)胞膜顆粒也是腫瘤細(xì)胞系擴增NK細(xì)胞的有效替代品，其不僅保持了誘導(dǎo)NK細(xì)胞擴增的膜受體的激活效率，而且避免了腫瘤細(xì)胞與擴增產(chǎn)物混合的風(fēng)險。

新的無飼養(yǎng)層擴張系統(tǒng)正在開發(fā)中，細(xì)胞因子如IL-2、IL-15和IL-21的單一或簡單組合被用于擴增細(xì)胞。細(xì)胞因子、鏈球菌和唑來膦酸鹽刺激臍血單個核細(xì)胞3周，可產(chǎn)生平均純度為95%的NK細(xì)胞，擴增倍數(shù)可達(dá)1561倍。這種無飼養(yǎng)層的方法降低了將其他類型的細(xì)胞引入最終產(chǎn)品的風(fēng)險，但NK細(xì)胞的純度仍需提高。

NK-92是第一個獲得FDA批準(zhǔn)用于臨床試驗的基于NK細(xì)胞的細(xì)胞系，是一種同質(zhì)的永生化NK淋巴瘤細(xì)胞系，可以在體外擴增以獲得大量細(xì)胞。NK-92細(xì)胞表面標(biāo)志CD56和CD25陽性，CD3、CD4、CD8、CD16、CD32、CD64和HLA-DR陰性。NK-92細(xì)胞的生長依賴于IL-2。由于其致癌特性，需要在患者給藥之前對NK-92衍生細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行輻射，這反過來又對其在體內(nèi)的長期持久性和整體治療潛力產(chǎn)生負(fù)面影響。另一個缺點是，由于缺乏CD16的表達(dá)，NK-92細(xì)胞缺乏通過ADCC介導(dǎo)細(xì)胞殺傷的能力。

不同于T細(xì)胞，NK細(xì)胞的一大獨特之處在于，并不局限于自體細(xì)胞，目前的臨床研究顯示CAR-NK細(xì)胞不會產(chǎn)生GvHD（移植物抗宿主病），因此安全性較高。同種異體CAR-NK獲取方便，質(zhì)量均一且時效高，副作用小。